Pemeriksaan Bakteri Legionella pada air

1.      Kultur

a)    Pembuatan kultur pada lempeng agar :

(1)  Seluruh sampel air disentrifus dengan gaya 6000 g (36.000 rpm) selama  10 menit atau difiltrasi dengan diameter pori 0,2 um.

(2)  Endapan atau filter yang sudah dipotong-potong di larutkan dengan 10 ml air steril. (3)  Kocok larutan dengan vortex.

(4)  Tanamkan larutan dengan ose pada lempeng agar yang sudah ditambah  dengan suplemen pertumbuhan dan suplemen selektif.

(5)  Inkubasikan pada suhu 350 C minimal 2 x 24 jam dalam CO2   2,5-5 % (inkubator CO2

atau sungkup lilin).

(6)  Amati lempeng agar pertumbuhan koloni Legionella tampak sebagai bulatan dengan tepi   meniggi,   mengkilap,   berwarna   putih   keabu-abuan   dan   lengket.   Dengan mikroskope  disekting  binokuler  tampak  tampilan  koloni  ground  glass  appearance (tembus  pandang).  Jika  jumlah  koloni  tampak  sangat  padat,  ulangi  penanaman

dengan mengambil 1 koloni, kemudian asamkan terlebih dahulu dengan 0,2  N HCL

selama 5 menit.

(7)  Lakukan pengukuran pH, bila pH <2 span="">,2 tambahkan KOH 1 M sedikit demi sedikit.

b). Pewarnaan gram:

(1)  Buat sediaan apus dari koloni bakteri yang berbentuk bulat dan konveks (cembung), putih keabu-abuan serta lengket.

(2)  Lakukan fixasi dengan methyl alkohol atau lewatkan di atas nyala api.

(3)  Teteskan larutan gentian violet pada preparat dan diamkan          selama 1 menit, lalu cuci dengan air mengalir.

(4)  Teteskan larutan lugol (iodine reagent) pada preparat dan diamkan selama  I  (satu)

menit, lalu cuci dengan air mengalir.

(5)  Teteskan alkohol absolut pada preparat dan diamkan selama 30 menit sampai warna hilang kemudian di cuci dengan air mengalir.

(6)  Teteskan larutan karbol fuhsin pada preparat dan diamkan selama 30 detik, kemudian dicuci dengan air mengalir dan keringkan di udara.

(7)  Periksa  dibawah  mikroskop  dengan  pembesaran  10  x  100  :  bakteri   Legionella berbentuk batang, gram negatif dengan ukuran 2-50 um dan lebar 0,5-1 um.

c) Permurnian koloni Legionella

(1)  Ambil kembali koloni dari hasil pada pewarnaan gram yang menunjukkan tersangka

Legionella dengan ose.

(2)  Tanamkan koloni pada lempeng agar yang sudah ditambah dengan suplemen selektif dan suplemen pertumbuhan.

(3)  Tanamkan juga koloni pada lempeng agar darah.

(4)  Inkubasikan pada suhu 35 0 C selama 2 x 24 jam di dalam sungkup lilin (candle jar)

yang ditambah CO2  5%.

(5)  Pertumbuhan koloni Legionella pada lempeng agar dengan suplemen  selektif dan

suplemen pertumbuhan tampak sebagai bulatan dengan tepi meninggi,  mengkilap,

berwarna  putih  keabu-abuan  dan  lengket.  Bila  hal  tersebut  terjadi  maka  koloni Legionella seharusnya tidak akan tumbuh pada lempeng agar  darah.  Bila tumbuh berarti bukan Legionella.

d)  Penyinaran dengan sinar Ultra Violet.

Sinari lempeng agar yang berisi koloni Legionella yang telah dimurnikan dengan sinar ultra violet pada panjang gelombang 360 nm.

Amati dan lakukan interpretasi terhadap warna fluoresensi yang timbul : 

(1)  Kemerahan : mungkin L.erythra/L.rubriluscesns

(2)  Kebiru-biruan                  :                   mungkin                 L.bozemanii/L.anisa/L.parisiensis/

L.dumoffii/L.gormanii/L.cherii.

(3)  Tidak berfluoresensi : mungkin L.pneumophila/L.spiritensis/ L.longbeachae/ L.jordanis dll.

e)     Uji Aglutinasi

(1)  Ambil kembali koloni yang sudah dimurnikan.

(2)  Lakukan  uji  aglutinasi  dengan  menggunakan  kit  aglutinasi  (prosedur   dan  cara pemeriksaan sesuai dengan petunjuk yang tertera pada kit yang dipergunakan).

(3)  Lakukan  pengamatan  terhadap  lempeng  aglutinasi,  bila  terjadi  aglutinasi  berarti

patogen (L.pneumophila).

2.      Uji biokimia

Uji biokimia dilakukan untuk memperkirakan jenis spesies bakteri Legionella. Lakukan pembuatan kultur pada lempeng agar :

a.      Lakukan pewarnaan Gram

b.      Lakukan pemurnian koloni Legionella

c.      Lakukan penyinaran koloni Legionella yang telah dimurnikan dengan sinar ultra violet. 

d.      Lakukan uji pergerakan (hanging drop method)

(1)  Lakukan inokulasi 1-2 koloni bakteri dalam 5 ml kaldu nutrient. 

(2)  Lakukan inkubasi 35 0 C selama 2-3 jam

(3)  Teteskan 1(satu) tetes suspensi bakteri di gelas penutup, tutup dengan gelas obyek cekung pada bagian cekungnya kemudian balikkan.

(4)  Amati pergerakan bakteri dengan mikroskop. Bedakan pergerakan bakteri dari gerak

Brown.

                                     e. Lakukan uji Catalase

(1)  ambil koloni dan sebar di atas kaca obyek

(2)  teteskan H2 O2  3% beberapa tetes

(3)  tutup dengan gelas penutup

(4)  amati bila positif ditunjukkan oleh adanya gelembung gas. 

  f.  Lakukan uji Oksidase

(1)  buat larutan segar (larutan baru)

(2)  teteskan 2 tetes larutan segar dengan pipet Pasteur di atas filter yang berdiameter pori

0,2 um dalam lempeng petri

(3)  ambil koloni bakteri dengan tusuk gigi steril, goreskan diatas filter yang berisi larutan tadi.

(4)  Amati bila hasil positif, goreskan koloni pada filter berwarna ungu gelap selama 10-60 detik.

g. Lakukan uji Gelatinase

(1)  siapkan nutrient gelatin dalam tabung

(2)  sentuh beberapa koloni dengan jarum

(3)  tusukkan jarum di tengah tabung nutrient gelatin sampai dengan 10 mm  dari dasar tabung

(4)  inkubasikan pada suhu 35 ° selama 24-48 jam

(5)  pindahkan tabung ke ice bath selama I jam, jangan dikocok atau di goyang.

(6)  Siapkan  tabung yang  berisi  nutrient  gelatin  dan bakteri  pseudomonas  aeruginosa sebagai kontrol positip, sedangkan tabung sebagai kontrol negatif hanya berisi nutrien gelatine

(7)  Balikkan tabung-tabung tersebut perlahan-lahan

(8)  Amati, bila kaldu mencair berarti hasil positif, bila tetap padat hasil negatif.

h.  Uji b- lactamase

Uji   dengan   menggunakan   cakram   nitrocefin,   prosedur   memperhatikan    petunjuk perusahaan pembuat.

i.   Uji hippurate hydrolysis

(1)  Biarkan Legionella yang telah dimurnikan berumur 24 – 96 jam.

(2)  Buat  larutan  sodium  hippurate  1%  dalam  tabung  dan  masukkan  koloni  bakteri sampai pekat.

(3)  Keluarkan tabung dari inkubator, dan tambahkan 0.2 ml larutan  ninhydrin  3.5%, dalam aseton-beitanol dengan perbandingan yang sama.

(4)  Inkubasikan pada suhu 350 C selama 18 – 20 jam.

(5)  Masukkan kembali tabung ke dalam inkubator selama 10 menit.

(6)  Keluarkan tabung dari inkubator dan langsung lakukan pengamatan.  Pengamatan dilakukan tidak lebih dari 20 menit setelah dikeluarkan dari inkubator.

(7)  Lakukan interpretasi, positif kuat berwarna ungu tua, positif lemah  berwarna ungu muda, dan negataif warna tidak berubah.

j. Interpretasi hasil uji biokimia

Interpretasi terhadap hasil uji biokimia dapat dilakukan dengan menggunakan tabel berikut :

Spesies	Gerak	Oxidase	Cata- lase	Gelati- nase	b-Lacta- mase	H. Hydro- lysis
L.pneumo-phila	+	+	+	+	+	+
L.longbeac	+	+	+	+	+	-
L.oakrid-gensis	-	-	+	+	+/-	-
L.dumofii	+	-	+	+	+	-
L.jordanis	+	+	+	+	+	-
L.feelei	+	-	+	-	-	-