1. Kultur
a) Pembuatan kultur pada lempeng agar :
(1) Seluruh sampel air disentrifus dengan gaya 6000 g (36.000 rpm) selama 10 menit atau difiltrasi dengan diameter pori 0,2 um.
(2) Endapan atau filter yang sudah dipotong-potong di larutkan dengan 10 ml air steril. (3)
Kocok larutan dengan vortex.
(4) Tanamkan larutan dengan ose pada lempeng agar yang sudah ditambah dengan suplemen pertumbuhan dan suplemen selektif.
(5) Inkubasikan pada suhu 350 C minimal 2 x 24 jam dalam CO2 2,5-5 % (inkubator CO2
atau sungkup lilin).
(6) Amati lempeng agar pertumbuhan koloni Legionella tampak
sebagai bulatan dengan
tepi meniggi, mengkilap, berwarna putih keabu-abuan dan lengket. Dengan mikroskope
disekting
binokuler
tampak tampilan
koloni ground glass appearance (tembus pandang). Jika jumlah
koloni
tampak sangat
padat, ulangi penanaman
dengan mengambil 1 koloni, kemudian asamkan terlebih dahulu dengan 0,2 N HCL
selama 5 menit.
(7) Lakukan pengukuran pH, bila pH <2 span="">,2 tambahkan KOH 1 M sedikit demi sedikit.
b). Pewarnaan gram:
(1) Buat sediaan apus dari koloni bakteri yang berbentuk bulat
dan
konveks (cembung), putih keabu-abuan serta lengket.
(2) Lakukan fixasi dengan methyl alkohol atau lewatkan di atas nyala api.
(3)
Teteskan larutan gentian violet pada preparat dan diamkan selama 1 menit, lalu
cuci dengan air mengalir.
(4) Teteskan larutan lugol (iodine reagent) pada preparat dan diamkan selama
I (satu)
menit, lalu cuci dengan air mengalir.
(5) Teteskan alkohol absolut pada preparat dan diamkan selama 30 menit sampai warna hilang kemudian di cuci dengan air mengalir.
(6) Teteskan larutan karbol fuhsin pada preparat dan diamkan selama 30 detik, kemudian dicuci dengan air mengalir dan keringkan di udara.
(7) Periksa
dibawah mikroskop dengan
pembesaran
10 x
100 : bakteri
Legionella berbentuk batang, gram negatif dengan ukuran 2-50 um dan lebar 0,5-1 um.
c) Permurnian koloni Legionella
(1) Ambil kembali koloni dari hasil pada pewarnaan gram yang menunjukkan tersangka
Legionella dengan ose.
(2) Tanamkan koloni pada lempeng agar yang sudah ditambah dengan suplemen
selektif dan suplemen pertumbuhan.
(3) Tanamkan juga koloni pada lempeng agar darah.
(4) Inkubasikan pada suhu 35 0 C selama 2 x 24 jam di dalam sungkup lilin (candle jar)
yang ditambah CO2 5%.
(5) Pertumbuhan koloni Legionella pada lempeng agar dengan suplemen selektif dan
suplemen pertumbuhan
tampak
sebagai bulatan dengan tepi meninggi, mengkilap,
berwarna putih keabu-abuan dan lengket.
Bila hal
tersebut terjadi maka koloni Legionella seharusnya tidak akan tumbuh pada lempeng agar darah. Bila tumbuh berarti bukan Legionella.
d) Penyinaran dengan sinar Ultra Violet.
Sinari lempeng agar yang berisi koloni Legionella yang telah dimurnikan dengan sinar ultra violet pada panjang gelombang 360 nm.
Amati dan lakukan interpretasi terhadap warna fluoresensi yang
timbul :
(1) Kemerahan : mungkin L.erythra/L.rubriluscesns
(2)
Kebiru-biruan : mungkin L.bozemanii/L.anisa/L.parisiensis/
L.dumoffii/L.gormanii/L.cherii.
(3) Tidak berfluoresensi : mungkin L.pneumophila/L.spiritensis/ L.longbeachae/
L.jordanis dll.
e) Uji Aglutinasi
(1) Ambil kembali koloni yang sudah dimurnikan.
(2) Lakukan uji aglutinasi dengan
menggunakan kit aglutinasi (prosedur
dan
cara pemeriksaan sesuai dengan petunjuk yang tertera pada kit yang dipergunakan).
(3) Lakukan pengamatan terhadap lempeng aglutinasi,
bila terjadi aglutinasi berarti
patogen (L.pneumophila).
2. Uji biokimia
Uji biokimia dilakukan untuk memperkirakan jenis spesies bakteri
Legionella. Lakukan pembuatan kultur pada lempeng agar :
a. Lakukan pewarnaan Gram
b. Lakukan pemurnian koloni Legionella
c. Lakukan penyinaran koloni Legionella yang telah dimurnikan dengan sinar ultra violet.
d. Lakukan uji pergerakan (hanging drop method)
(1) Lakukan inokulasi 1-2 koloni bakteri dalam 5 ml kaldu
nutrient.
(2) Lakukan inkubasi 35 0 C selama 2-3 jam
(3) Teteskan 1(satu) tetes suspensi bakteri di gelas penutup, tutup dengan gelas obyek cekung pada bagian cekungnya kemudian balikkan.
(4) Amati pergerakan bakteri dengan mikroskop. Bedakan pergerakan bakteri
dari gerak
Brown.
e. Lakukan uji Catalase
(1) ambil koloni dan sebar di atas kaca obyek
(2) teteskan H2 O2 3% beberapa tetes
(3) tutup dengan gelas penutup
(4)
amati bila positif ditunjukkan oleh adanya gelembung gas.
f. Lakukan uji Oksidase
(1) buat larutan segar (larutan baru)
(2) teteskan 2 tetes larutan segar dengan pipet Pasteur di atas filter yang berdiameter pori
0,2 um dalam lempeng petri
(3) ambil koloni bakteri dengan tusuk gigi steril, goreskan diatas filter yang berisi larutan
tadi.
(4) Amati bila hasil positif, goreskan koloni pada filter berwarna ungu gelap selama 10-60 detik.
g. Lakukan uji Gelatinase
(1) siapkan nutrient gelatin dalam tabung
(2) sentuh beberapa koloni dengan jarum
(3) tusukkan jarum di tengah tabung nutrient gelatin sampai dengan 10 mm dari dasar tabung
(4) inkubasikan pada suhu 35 ° selama 24-48 jam
(5) pindahkan tabung ke ice bath selama I jam, jangan dikocok atau di goyang.
(6) Siapkan tabung yang berisi
nutrient gelatin dan bakteri pseudomonas aeruginosa sebagai kontrol positip, sedangkan tabung sebagai kontrol negatif hanya berisi nutrien gelatine
(7) Balikkan tabung-tabung tersebut perlahan-lahan
(8) Amati, bila kaldu mencair berarti hasil positif, bila tetap padat hasil negatif.
h. Uji b- lactamase
Uji dengan menggunakan cakram nitrocefin, prosedur memperhatikan
petunjuk perusahaan pembuat.
i. Uji hippurate hydrolysis
(1) Biarkan Legionella yang telah dimurnikan berumur 24 – 96 jam.
(2)
Buat
larutan sodium hippurate
1% dalam tabung dan masukkan koloni
bakteri sampai pekat.
(3)
Keluarkan tabung dari inkubator, dan tambahkan 0.2 ml larutan ninhydrin
3.5%, dalam
aseton-beitanol dengan perbandingan yang sama.
(4) Inkubasikan pada suhu 350 C selama 18 – 20 jam.
(5) Masukkan kembali tabung ke dalam inkubator
selama 10 menit.
(6)
Keluarkan tabung dari inkubator dan langsung lakukan pengamatan. Pengamatan dilakukan tidak lebih dari 20 menit setelah dikeluarkan dari inkubator.
(7)
Lakukan interpretasi, positif kuat berwarna ungu tua, positif lemah berwarna ungu muda,
dan
negataif warna tidak berubah.
j. Interpretasi hasil uji biokimia
Interpretasi terhadap hasil uji biokimia dapat dilakukan dengan menggunakan tabel berikut :
|
Spesies
|
Gerak
|
Oxidase
|
Cata-
lase
|
Gelati-
nase
|
b-Lacta-
mase
|
H. Hydro-
lysis
|
|
L.pneumo-phila
|
+
|
+
|
+
|
+
|
+
|
+
|
|
L.longbeac
|
+
|
+
|
+
|
+
|
+
|
-
|
|
L.oakrid-gensis
|
-
|
-
|
+
|
+
|
+/-
|
-
|
|
L.dumofii
|
+
|
-
|
+
|
+
|
+
|
-
|
|
L.jordanis
|
+
|
+
|
+
|
+
|
+
|
-
|
|
L.feelei
|
+
|
-
|
+
|
-
|
-
|
-
|
